形狀記憶合金（shape memory alloys，SMA）是一類具有在熱機(jī)械變形或磁變形等特定刺激作用下保持預(yù)編程形狀能力的形狀記憶材料[1]。自1932 年 SMA被發(fā)現(xiàn)后，已發(fā)現(xiàn)幾十種不同的合金材料具有形狀記憶效應(yīng)，可概括為鎳鈦（NiTi）合金、鐵基合金、鎂基合金和銅基合金[2]。由于具有優(yōu)異的生物相容性[3]、穩(wěn)定性[4]和熱機(jī)械性能，以 NiTi合金（nickel-titanium alloy或 Ni-Ti alloy）為基礎(chǔ)的 SMA在大多數(shù)應(yīng)用中更為可取，如航空航天、骨科植入物和固定裝置、聯(lián)接器和緊固件、電氣安全裝置、海軍、運(yùn)動(dòng)設(shè)備以及外科手術(shù)器械等[5-6]。

然而，由于鎳鈦合金中含鎳量達(dá)50 at%左右，一旦植入體發(fā)生腐蝕，鎳離子（Ni2+）就會(huì)溶出向四周擴(kuò)散導(dǎo)致細(xì)胞畸變，甚至產(chǎn)生癌變作用，影響其本身性能，從而限制了它在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的長(zhǎng)期使用[7]。為此，國(guó)內(nèi)外學(xué)者嘗試做了大量的表面處理，采用物理化學(xué)、電化學(xué)、形態(tài)學(xué)及生物化學(xué)等多種方法對(duì)鎳鈦記憶合金表面進(jìn)行改性，如等離子噴涂

[8]、離子注入[9]、電解拋光[10]、陽極氧化[11]、酸堿處理[12]等，這些技術(shù)均在不同程度上取得了良好的效果，但都有各自的不足之處。孫向東等[13]研究指出，鎳鈦合金去合金化的實(shí)現(xiàn)途徑有兩種：一是降低去合金液內(nèi)的鎳離子濃度；二是在表面形成穩(wěn)定的鈦氧化物。因此本研究選用強(qiáng)氧化劑過氧化氫溶液對(duì)鎳鈦合金進(jìn)行處理，旨在確保其生物安全性的同時(shí)，能在鎳鈦合金表面形成穩(wěn)定的氧化物。

本研究將對(duì)3D打印鎳鈦合金進(jìn)行去合金化處理并與酸蝕處理對(duì)比，研究其理化特征、成骨活性功能，旨在探究一種更加簡(jiǎn)便、高效的表面處理方式，以保障其安全性，并提升它的耐腐蝕能力及生物性能，為鎳鈦合金作為醫(yī)用材料特別是植入 /介入器械的長(zhǎng)期安全臨床應(yīng)用，提供可借鑒的思路和理論指導(dǎo)。

一、材料與方法

1、主要材料及試劑、儀器：

鎳鈦合金粉末（德普潤(rùn)新材料，北京）；人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（human bone marrow mesenchymalstem cells，hBMSCs）（佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院提供）；過氧化氫溶液（大茂化學(xué)試劑，天津）；鹽酸溶液（歐博凱化工，天津）；硫酸溶液（歐博凱化工，天津）；MEM培養(yǎng)基（Biosharp，上海）；胎牛血清（Gibco，美國(guó)）；CCK-8 細(xì)胞檢測(cè)試劑盒（Beyotime，上海）；Mlab 3D打印機(jī)（GE Additve，美國(guó)）；FV1000 激光共聚焦顯微鏡（Olympus，日本）；JC200001 接觸角測(cè)量?jī)x（中晨設(shè)備，上海）；RS232 多功能酶標(biāo)儀（麥莎生物，上海）。

2、實(shí)驗(yàn)分組及方法：

使用 Geomagic Design X軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)建模，鎳鈦試件尺寸設(shè)計(jì)為直徑10 mm、厚度為2 mm的圓片，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入3D打印機(jī)中，選擇鎳鈦合金打印參數(shù)進(jìn)行打印，本實(shí)驗(yàn)使用的鎳鈦合金粉末為平均粒徑10~53 μm的球形近等原子比粉末。

A組：使用150 目 Al2O3 砂礫，噴砂角度為90°，壓強(qiáng)為0.2 MPa，時(shí)間60 秒，對(duì)樣品進(jìn)行噴砂處理。

B組：將以上噴砂后的試樣放入70℃的鹽酸與硫酸（濃度比例1:1）溶液中酸蝕處理60 分鐘。

C組：將噴砂處理后的試樣置于80℃濃度為15%、pH為3 的過氧化氫溶液中3 小時(shí)，進(jìn)行去合金處理。

3、 觀測(cè)指標(biāo)：

（1）表面理化性能表征：

每 組 各 取1 個(gè) 樣 品， 用 掃 描 電 子 顯 微 鏡（scanning electron microscope, SEM） 觀 察 表 面形貌特征；每組取3 個(gè)樣品，用能譜儀（energydispersive spectrometer, EDS）對(duì)各組表面成分進(jìn)行分析，測(cè)量后取均值；室溫下用接觸角測(cè)量?jī)x測(cè)量表面接觸角。

（2）體外細(xì)胞相容性評(píng)價(jià)：

①細(xì)胞培養(yǎng)48 小時(shí)后每組各取1 個(gè)樣品，處理后加入鬼筆環(huán)肽與赫斯特細(xì)胞核藍(lán)色熒光染料（Hoechst 33342）分別進(jìn)行細(xì)胞骨架和細(xì)胞核染色，然后利用激光共聚焦掃描顯微鏡（laserscanning confocal microscope, LSCM）對(duì)細(xì)胞位置和蛋白骨架進(jìn)行觀察。每組取3 個(gè)樣品置于24孔板中，每孔加入3×10⁴ 個(gè) hBMSCs 懸液500 μL與試樣共培養(yǎng)，置于37℃、5% CO₂ 培養(yǎng)箱培養(yǎng)1、3、5 天后，每組5 個(gè)復(fù)孔，用 CCK-8 試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。②在滅菌后的試樣表面以2×10⁴ 個(gè)細(xì)胞 /每孔接種，并用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，3 天后換 成誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)，隔天更換1 次培養(yǎng)基，采用天狼星紅染色方法測(cè)定 I型膠原分泌情況。③茜素紅染色法測(cè)定細(xì)胞外基質(zhì)的礦化程度。

4、 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：

采用 Graphpad Prism 8 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用平均值 ±標(biāo)準(zhǔn)差表示，如果 P<0.05，則認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1、 表面理化性能表征：

SEM結(jié)果顯示噴砂組表面呈形狀不規(guī)則的凹坑和沖擊痕；酸蝕組形成類似纖維網(wǎng)格狀的結(jié)構(gòu)；去合金組表面獲得了均勻、多孔的納米網(wǎng)架結(jié)構(gòu)（圖1）。

EDS結(jié)果如表1，去合金后表面鎳元素（Ni）含量比其他兩組明顯降低，為18.6 wt%，氧元素（O）含量也較其他兩組高。

接觸角測(cè)量?jī)x檢測(cè)結(jié)果如圖2，噴砂組、酸蝕組和去合金組的表面水接觸角分別為76.99°±7.03°、62.05°±4.14°和17.67°±2.66°，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

2、體外細(xì)胞相容性評(píng)價(jià)：

（1）細(xì)胞形態(tài)觀察：

圖3 所示，在噴砂處理后，表面上 hBMSCs數(shù)量較少且未見到偽足生長(zhǎng)，也無明顯的鋪展；在酸蝕處理組試樣的表面，細(xì)胞的生長(zhǎng)形態(tài)相似，偽足增多，向四周鋪展，細(xì)胞數(shù)量也有所增加；在去合金組的試樣表面，所有細(xì)胞都鋪展良好，覆蓋的面積也較其他組增大，并且向三維方向伸展，偽足和胞間連絲都增加，細(xì)胞之間已沒有了界限。

（2）細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：

CCK-8 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，培養(yǎng)1、3、5 天后，各組細(xì)胞的生長(zhǎng)速度隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈遞增趨勢(shì)，不同時(shí)間點(diǎn)的比較有顯著性差異（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，去合金組試樣表面的細(xì)胞增殖最快，酸蝕組次之，噴砂組最慢（圖4）。

（3）細(xì)胞分化能力檢測(cè)：

圖5、圖6 分別是不同樣品表面誘導(dǎo)細(xì)胞培養(yǎng)7 天和14 天后Ⅰ型膠原分泌與細(xì)胞外基質(zhì)礦化的結(jié)果，隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，去合金組的Ⅰ型膠原和細(xì)胞外基質(zhì)礦化水平增加最多，增長(zhǎng)速度也較其他組更快，說明去合金化處理能夠促進(jìn) hBMSCs分化，且隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)hBMSCs分化的促進(jìn)作用更明顯。

三、討論

作為植入材料，未經(jīng)處理的3D打印鎳鈦合金表面由于較粗糙，沒有微孔結(jié)構(gòu)，不利于細(xì)胞的識(shí)別和黏附，且其在接觸體液時(shí)，因?yàn)楦g可能導(dǎo)致植入體鎳離子的釋放，可能會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生毒性[14-15]，因此必須不斷通過各種表面處理方法提高鎳鈦合金植入物的理化特性，從而增強(qiáng)植入物的生物學(xué)性能，提高生物相容性，促進(jìn)植入體與骨組織的結(jié)合，縮短愈合時(shí)間。去合金是一種以化學(xué)或電化學(xué)的方式，對(duì)一種或幾種金屬進(jìn)行選擇性的蝕刻，然后用不同材料之間的電勢(shì)差異，將一種以上的活性金屬離子進(jìn)行選擇性的溶解，以獲得具有連續(xù)的十納米到幾百微米的三維孔隙結(jié)構(gòu)[16]。目前，去合金法由于其經(jīng)濟(jì)、高效、可控等優(yōu)點(diǎn)在納米多孔體的制造中得到了越來越多的重視，但目前國(guó)內(nèi)對(duì)鎳鈦合金去合金的相關(guān)報(bào)道較少，且去合金后的鎳鈦合金生物相容性有待進(jìn)一步檢驗(yàn)。

本研究中去合金處理后的表面較其他兩組形成更加豐富的納米級(jí)網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，說明它可以使噴砂后的不規(guī)則表面產(chǎn)生多級(jí)孔隙，也因此可以消除噴砂后表面形成的不規(guī)則淺坑，而且相較于酸蝕后的表面，去合金可以使表面孔洞加深、數(shù)量增多，排列也更緊密，為表面親水性能提供了形貌基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，與其他兩組相比，去合金表面的鎳元素含量降至18.6 wt%，大大降低了鎳離子釋放對(duì)人體產(chǎn)生毒性的可能；在去合金組，氧元素的含量也明顯增加，表明其對(duì)金屬的氧化有一定促進(jìn)作用，在其表面可能形成親水性的氧化鈦膜層[17]。

理想的植入體應(yīng)具有良好的細(xì)胞相容性和良好的成骨活性。本研究在去合金化的過程中，表面增加了納米級(jí)網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，為細(xì)胞的附著和延伸創(chuàng)造了更多空間，從而使其更多地向三維方向延伸，而圍繞著網(wǎng)格突起的邊緣也“錨定”了由細(xì)胞延伸出來的偽足，并且與試件接觸更加緊密。表明隨著植入體潤(rùn)濕性的增大，其擴(kuò)展區(qū)域也隨之增大[18]。Hallab等[19]的實(shí)驗(yàn)還表明，植入體的表面與親水性的關(guān)系比，表面粗糙度對(duì)其影響更明顯。從體外細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)可以看出，各組樣品都支持細(xì)胞的增殖與分化，隨著植入體浸潤(rùn)性的增強(qiáng)，其細(xì)胞增殖能力和骨結(jié)合能力也隨之增強(qiáng)[20]，同時(shí)也說明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠承受樣品釋放的 Ni2+，有研究也證明等原子比鎳鈦合金對(duì)細(xì)胞具有極低的毒性，表明其具有良好的生物相容性[21]。

本研究中去合金化形成的納米級(jí)網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)表面是一種良好的表面改性方法，優(yōu)化了試件的表面性能，具有良好的細(xì)胞相容性，并且能夠促進(jìn)成骨功能的表達(dá)，有望改善鎳鈦植入物的骨結(jié)合能力和植入物的長(zhǎng)期穩(wěn)定，但其在體內(nèi)的相關(guān)指標(biāo)驗(yàn)證還需進(jìn)一步通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來實(shí)現(xiàn)。

利益沖突 本文作者均聲明不存在利益沖突作者貢獻(xiàn)聲明 秦欣玉：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)實(shí)施、數(shù)據(jù)分析和論文寫作等全過程；張亮、陳瑩瑩、韓澤奎：參與實(shí)驗(yàn)實(shí)施；宿玉成、王心彧：提供研究經(jīng)費(fèi)、論文修改和審閱指導(dǎo)。

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